MEDIA DAN STERILISASI

MEMBUAT MEDIA DAN STERILISASI

I.            TUJUAN PERCOBAAN

Ø  Untuk pemeliharaan kultur mikroorganisme, sehingga bila diperlukan selalu tersedia.

Ø  Memahami prinsip sterilisasi.

Ø  Memahami dan melakukan metode-metode sterilisasi.

Ø  Mengetahui cara kerja autoklaf.

II.            ALAT DAN BAHAN

A.    Alat-alat

Ø  Autoklaf

Ø  Gelas kimia

Ø  Erlenmeyer

Ø  Tabung reaksi

Ø  Labu semprot

Ø  Pengaduk

Ø  Hot plate

Ø  Spatula

Ø  Gunting

B.     Bahan-bahan

Ø  Ekstrak toge

Ø  Aquades

Ø  Bakto agar-agar

Ø  Ekstrak daging

Ø  Glukosa

Ø  Pepton

Ø  Kapas

Ø  Aluminium foil

Ø  Kasa

Ø  Benang

III.            DASAR TEORI

Kelangsungan hidup organisme tergantung dari persediaan makanan yang cukup dan lingkungan yang memungkinkan untuk berkembang biak. Makanan yang kompleks ini terdegradasi secara enzimatik menjadi zat-zat yang lebih sederhana. Suatu larutan yang mengandung nutrisi-nutrisi ini disebut media kultur. Secara fisik media kultur terbagi dalam tiga bagian  yaitu media cair (nutrient broth), media semi padat dan media padat (nutrient agar). Jika media cair dibubuhi agar-agar akan terbentuk media padat atau semi padat tergantung dari banyaknya agar-agar yang ditambahkan ke dalamnya.

 Untuk membentuk media padat, penambahan agar-agar 1,5-2%, sedangkan untuk media semi padat penambahan agar-agar 1,5-2%, sedangkan untuk media semi padat penambahan agar-agar kurang dari 1%. Agar-agar mempunyai sifat dapat cair pada suhu 100⁰C dan mulai beku pada suhu 40⁰C.Pada sifat inilah yang mendukung pertumbuhan mikroorganisme terutama yang dapat pada tumbuh pada 37⁰C tanpa mengalami pencairan. Selain itu media agar mempunyai permukaan yang keras dan halus, sehingga dapat digunakan untuk teknik isolasi koloni. Tujuan membuat media adalah untuk pemeliharaan kultur mikroorganisasi, sehinggn bila diperlukan selalu tersedia.

STERILISASI

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri (Fardiaz, 1992). Preses sterilisasi sangat diperlukan untuk menghilangkan mikroba pada alat dan media yang akan digunakan dalam kerja mikrobiologi. Piring petri / petri disk, tabung reaksi, pipet, ose, dan media harus bebas dari mikroba sebelum kita gunakan untuk keperluan kerja aseptis.

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.

1.    Sterilisasi secara mekanik ( filtrasi )

Yaitu sterilisasi dengan menggunakan Sesuatu saringan yang berpori sangat kecil ( 0.22 mikron atau 0,45 mikron ) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini di tujukan untuk sterilisasi bahan yang sangat peka panas, misalnya : larutan enzim, vitamin, dan antibiotic. Namun, cara ini mempunyai kelemahan yaitu golongan virus mampu menembus filter / saringan sterilisasi.

2.    Sterilisasi secara fisik ( Pemanasan dan Penyinaran )

• Pemanasan

Cara pemanasan dibagi menjadi 2, yaitu :

a)      Pemanasan kering, yaitu proses pemanasan yang tidak menggunakan air.
Contoh : Membakar, Menggunakan udara panas ( oven )

b)      Pemanasan basah, yaitu proses pemanasan dengan menggunakan air.
Contoh : Merebus, Uap air panas, Uap air panas bertekanan

• Penyinaran ( Radiasi )

Beberapa sinar yang biasa digunakan dalam proses sterilisasi :

a)      Sinar Ultra Violet ( UV ) Sinar ini mempunyai daya bakterisid yang tinggi sehingga biasa digunakan untuk mensterilkan ruangan. Contoh : Kamar bedah, Ruang pengisian obat dalam ampul dan flakon di industry farmasi, Ruang penanaman bakteri dalam media.

b)      Sinar Gama Sinar ini mempunyai daya penetrasi yang lebih besar dari sinar X digunakan untuk mensterilkan material tebal. Contoh : Bungkusan alat-alat kedokteran, Paket makanan.

c)      Sinar  Katoda

d)     Sinar ini digunakan untuk menghapus hama pada suhu kamar terhadap barang-barang yang telah dibungkus.

3.    Sterilisasi secara kimiawi ( cara khemis )

   Yaitu sterilisasi dengan menggunakan bahan kimia. Biasanya menggunakan senyawa disinfektan. Disinfektan adalah suatu bahan kimia yang dpat membunuh sel-sel vegetative dari jasad renik. Prosesenya disebut disinfeksi.

Zat-zat kimia yang bersifat disinfeksi :

a)      Fenol dan derivatnya sebagai desinfektan maupun antiseptic

b)      Alkohol, contoh : etanol 50-70 %

c)      Halogen beserta gugusnya, contoh : iodin (menginfeksi kulit sebelum pembedahan), hypoklorit (sanitasi alat-alat rumah tangga)

d)     Logam berat, contoh: merkurochrom, mertiolat (antiseptic), perak nitrat (tetes mata pencegah penyakit mata pada bayi)

e)      Detergen

f)       Aldehid, contoh : formalin

g)      Gas sterilisator, digunakan untuk bahan atau alat yang tidak dapat disterilkan dengan panas tinggi atau dengan zat kimia cair. Pda proses ini material di sterilkan dengan gas etilen oksida pada suhu kamar. Kelebihan gas tersebut adalah daya sterilisasi dan penetrasinya besar. Namun, kekurangannya adalah bersifat toksik dan mudah meledak.

Ada beberapa macam sterilisasi, yaitu dengan menggunakan panas, saringan dan bahan kimia. Sterilisasi dengan menggunakan panas dibagi tiga bagian yaitu sterilisasi kering (suhu oven 160⁰C – 170⁰C selama 2-3 jam). Sterilisasi basah menggunakan tekanan uap pada suhu 100⁰C (untuk bahan yang termolabil seperti gula dan susu). Sedangkan untuk media yang termostabil menggunakan tekanan tekanan uap pada suhu diatas 100⁰C dan menggunakan alat autoklaf. Sterilisasi dengan bahan kimia misalnya ethylene oxide, sedangkan sterilisasi dengan saringan misalnya Millipore filter. Tujuan sterilisasi supaya bahan-bahan dan alat yang digunakan tidak mengandung mikroorganisme. Dalam praktikum ini, sterilisasi yang digunakan adalah sterilisasi basah.

AUTOKLAF

Autoklaf adalah alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (121⁰C, 15 lbs) selama kurang lebih 15 menit. Penurunan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah yang akan membunuh microorganisme. Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Pada spesies yang sama, endospora dapat bertahan pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh sel vegetatif bakteri tersebut. Endospora dapat dibunuh pada suhu 100 °C, yang merupakan titik didih air pada tekanan atmosfer normal. Pada suhu 121 °C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit, dimana sel vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu 65 °C.

Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai 121 °C. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas pada bagian dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan total untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 °C untuk waktu 10-15 menit. Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume besar akan diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mencapai suhu sterilisasi. Performa autoklaf diuji dengan indicator biologi, contohnya Bacillus stearothermophilus.

Terdapat tiga jenis autoklaf, yaitu gravity displacement, prevacuum atau high vacuum, dan steam-flush pressure-pulse. Perbedaan ketiga jenis autoklaf ini terletak pada bagaimana udara dihilangkan dari dalam autoklaf selama proses sterilisasi.

IV.            CARA KERJA

A.    Membuat media

1)       Ditimbang toge yang telah di bersihkan, dan dicuci bersih sebanyak 15 gram, ditambahkan aquades sampai 150 ml.

2)       Didihkan selama 20 menit, jika volume berkurang, tambahkan kembali aquades.

3)       Disaring, dan kemudian ditambahkan glukosa sebanyak 3 gram dan bakto agar sebanyak 3 gram.

4)       Panaskan sambil aduk sampai mendidih.

5)       Dimasukkan kurang lebih 5 ml ke dalam masing-masing tabung reaksi, kemudian ditutup dengan sumbat kapas dan aluminium foil.

6)       Kemudian disterilkan didalam autoklaf.

7)       Ditunggu sampai sekitar ±20 menit.

8)       Setelah itu dikeluarkan tabung reaksi, dinginkan dengan cara dimiringkan.

9)       Setelah beku, media agar miring siap digunakan.

B.     Sterilisasi

1)         Diisi autoklaf dengan aquades. Pasang stop kontak, atur suhu pada 121⁰C.

2)         Setelah mendidih, dimasukkan alat-alat dan bahan yang akan disterilkan.

3)         Ditutup autoklaf, tutup juga klep udaranya.